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免疫荧光显微法(IF)实验操作流程
2015-10-15

1.试剂和溶液

10X PBS80g NaCl2g KCl, 14.4g Na2HPO4 2.4g KH2PO4 1L纯水,调pH至 7.4
洗涤液:1× PBS:纯水稀释10X PBS1× PBST:含0.05% Tween-20 1×PBS
固定液:4%多聚甲醛:4g多聚甲醛溶于100ml PBS
通透液:0.1% triton-100
封闭液:PBS配制的3% BSA
抗体稀释液:一抗稀释液:3% BSA;二抗及鬼笔环肽稀释液:1X PBSDAPI: 纯水稀释 

2.实验步骤

1

细胞爬片:将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌,铺在12孔板中,然后接种细胞,置于37℃,5% CO2培养箱过夜,待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态,细胞密度为40%-50%(做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2代后的细胞); 

2

洗涤:倒掉细胞培养液,1×PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 

3

固定:4%多聚甲醛固定细胞,室温放置20min,倒掉多聚甲醛,加入适量PBS; 

4

冻存:-20℃保存(如果直接使用,可跳至7); 

5

解冻:常温下放置30 min; 

6

洗涤: PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 

7

通透:加入适当体积的通透液室温放置10min。(若蛋白为膜表达则无需此步) 

8

洗涤:PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 

9

封闭:加入适当体积的封闭液,室温放置30 min; 

10

一抗孵育:倒掉封闭液,加入适当体积及浓度的一抗,37℃孵育60min; 

11

洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 

12

二抗孵育:加入适当体积及稀释比的荧光二抗, 37℃避光孵育50 min;(如果一抗是荧光素标记的则无需此步); 

13

洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 

14

核染色:加入适当体积及稀释比的核染料DAPI室温反应10min (如果无需加鬼笔环肽,可洗涤后跳至16); 

15

洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 

16

细胞骨架染色:此步骤只针对有细胞核定位的项目;加入反应体积为0.2ml,适当稀释比的鬼笔环肽,避光37℃孵育60 min或4℃孵育过夜; 

17

洗涤:PBST轻微振荡洗涤2次,每次5min,纯水轻微振荡洗涤5min; 

18

封片:取干净的载玻片,分别标记和编号,在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂,用镊子取出盖玻片,细胞面朝下,盖在载玻片上; 

19

荧光显微镜观察,记录结果。 



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