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上海俊喆生物技术公司
Shanghai Junzhe Biotechnology Co., Ltd
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    公司目前代理品牌如下:美国biolegend, 美国peprotech, 美国cst, 美国abcam, 美国santa cruz公司,台湾Abnova,美国Biovision,美国Thermo,美国NEB,美国Abgent,SIGMA Aldrich,美国Hyclone,美国labvision, 美国MRC, 美国Agdia, 美国Jackson, 美国Rd, 美国eBioscience, 美国Axygen, 美国Bio-Rad, 美国Millipore, 美国Qiagen, 美国Novus.
  • 细胞/组织裂解液制备流程

    1.试剂和溶液RIPA buffer:20mM Tris (pH 7.5),150mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,2.5mM sodium pyrophosphate,1mM beta-glycerophosphate disodium salt hydrate,1mM Na3VO4,1µg/ml leupeptin hemisulfate salt,1% sodium deoxycholate,1% Triton X-100,1mM PMSF2.实验步骤--细胞裂解液制备1细胞收集:选择对数生长期的细胞,用预冷的PBS洗涤细胞,3000rpm,离心5min,弃上清;2细胞裂解:将细胞沉淀轻轻弹散,然后加适量预冷的RIPA buffer和PMSF进行裂解(1个100mm直径细胞培养皿加入100-200μl裂解液, 1ml RIPA buffer加10μl PMSF),放置于冰上,轻轻吹散细胞悬液,放置4℃冰箱或冰水混合物中裂解40-60min;3超声处理:首先观察裂解情况,如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理,否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下:设置参数:次数10-30次,每次时间5-10s,取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里(冰上超声),超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清,如果有浑浊,需再次进行超声;4离心测蛋白浓度:13000rpm 4℃,离心8min,取上清。另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度;5细胞裂解液处理:加入适量的5*Loading Buffer,混匀后沸水浴5-10min,取出0.5ml样品进行电泳及WB检测,其它分装置于-20℃保存。3.实验步骤—组织裂解液制备1取组织:新鲜或从-80℃冰箱/液氮中取出需要制备裂解液的组织,待组织解冻后放在盛有PBS液的培养皿中,用镊子夹住组织洗净组织中残留的血,并且尽可能除去脂肪和外膜;2把洗净的组织放入培养皿中,用剪刀将组织剪成小块(尽可能的小);3裂解:将剪碎的组织小块转移至研磨器中,在冰浴中进行研磨一定次数后,加入适量预冷的RIPA buffer和PMSF继续研磨至组织无明显块状即可(一般 1ml RIPA buffer加10μl PMSF);4将研磨好的组织裂解悬液转移至干净的离心管中,再用少量的RIPA buffer和PMSF清洗研磨器并倒入离心管中,冰浴中放置40-60min, 充分裂解,可间隔摇晃离心管或吹打数次;5超声处理:首先观察裂解情况,如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理,否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下:设置参数:次数10-30次,每次时间5-10s,取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里(冰上超声),超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清,如果有浑浊,需再次进行超声;6离心测蛋白浓度:13000rpm 4℃,离心8min,取上清(小心表面的脂肪和管底的组织碎片),另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度;7组织裂解液处理:加入适量的5*Loading Buffer,混匀后沸水浴5-10min,取出0.5ml样品进行电泳及WB检测,其它分装置于-20℃保存。  
  • 免疫荧光显微法(IF)实验操作流程

    1.试剂和溶液10X PBS:80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L纯水,调pH至 7.4洗涤液:1× PBS:纯水稀释10X PBS;1× PBST:含0.05% Tween-20 的1×PBS固定液:4%多聚甲醛:4g多聚甲醛溶于100ml PBS通透液:0.1% triton-100封闭液:PBS配制的3% BSA抗体稀释液:一抗稀释液:3% BSA;二抗及鬼笔环肽稀释液:1X PBS;DAPI: 纯水稀释 2.实验步骤1细胞爬片:将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌,铺在12孔板中,然后接种细胞,置于37℃,5% CO2培养箱过夜,待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态,细胞密度为40%-50%(做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2代后的细胞); 2洗涤:倒掉细胞培养液,1×PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 3固定:4%多聚甲醛固定细胞,室温放置20min,倒掉多聚甲醛,加入适量PBS; 4冻存:-20℃保存(如果直接使用,可跳至7); 5解冻:常温下放置30 min; 6洗涤: PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 7通透:加入适当体积的通透液室温放置10min。(若蛋白为膜表达则无需此步) 8洗涤:PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 9封闭:加入适当体积的封闭液,室温放置30 min; 10一抗孵育:倒掉封闭液,加入适当体积及浓度的一抗,37℃孵育60min; 11洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 12二抗孵育:加入适当体积及稀释比的荧光二抗, 37℃避光孵育50 min;(如果一抗是荧光素标记的则无需此步); 13洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 14核染色:加入适当体积及稀释比的核染料DAPI室温反应10min (如果无需加鬼笔环肽,可洗涤后跳至16); 15洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 16细胞骨架染色:此步骤只针对有细胞核定位的项目;加入反应体积为0.2ml,适当稀释比的鬼笔环肽,避光37℃孵育60 min或4℃孵育过夜; 17洗涤:PBST轻微振荡洗涤2次,每次5min,纯水轻微振荡洗涤5min; 18封片:取干净的载玻片,分别标记和编号,在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂,用镊子取出盖玻片,细胞面朝下,盖在载玻片上; 19荧光显微镜观察,记录结果。 
  • 酶联免疫(ELISA)实验操作流程

    1.溶液和试剂1)10 X PBS: 80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水,调pH至 7.42)包被液:1X PBS 3)洗涤液:含0.05% Tween-20 的1X PBS(1X PBST)或纯水4)封闭液:10 mg/ml BSA(1% BSA,1X PBS配置)5)抗体稀释液:一抗、二抗均用1%BSA-PBS6)2M H2SO4终止显色: 108ml 98%H2SO4,加纯水稀释到1L 2.实验步骤1抗原准备:将抗原按适当浓度溶解于包被液中; 2包被:在对应的孔中加入100μl抗原,37℃孵育2小时或4℃过夜;3洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗5次;  4封闭:每孔加200μl封闭液,37℃孵育1小时;  5洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗3次; 6一抗:每孔加100μl一抗,37℃孵育2小时; 7洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗7次; 8二抗:每孔加100μl二抗,37℃孵育1小时; 9洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗7次; 10显色:拍干孔中残留液体,每孔加100μl TMB显色液,37℃避光显色10min;11检测:每孔加50μl 2M H2SO4终止显色,并立即读取450nm OD值。 
  • 免疫组织化学(IHC)实验操作流程

    1.试剂和溶液乙醇: 无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇抗原修复液: 0.01M的柠檬酸钠缓冲液:58.82g柠檬酸三钠及7.56g柠檬酸溶于200ml纯水,调pH至 6.0,纯水1:100稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9稀释10X PBS: 80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水,调pH至 7.4洗涤液: 1×PBS:纯水稀释10× PBS;1× PBST:含0.05% Tween-20 的1×PBS(1×PBST)super block,生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent二抗,酶标亲和素UltraTek HRP,DAB显色试剂盒:Cat. KT1002a抗体稀释液:3%BSA-PBS0.5%盐酸-乙醇:0.5~1%盐酸,95.0~95.5%乙醇苏木素:苏木精2g溶于250ml无水乙醇,十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml纯水,以上溶液充分混合,加入碘酸钠 0.2g和冰醋酸20ml 2.实验步骤1组织固定:烘箱温度65-75℃ 30min或者65℃过夜;2脱蜡:二甲苯浸泡三次,每次10分钟;3水化:依次经过无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇浸泡,每次5min;4洗涤:自来水冲洗1次,PBS浸泡3min;5抗原修复:放入稀释100倍的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0) 中,高压锅煮沸10min,常温冷却30min;6洗涤:纯水浸泡2次,PBS浸泡1次,每次3min;7灭活酶:室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min;8洗涤:纯水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;9封闭:加入适当体积的super block(KT1002a Reagent A),37℃温箱孵育5min;10洗涤:纯水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;11一抗:加入反应体积为0.15ml,适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。12洗涤:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;13加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗(KT1002a Reagent B),37℃湿盒孵育10min;14洗涤:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;15加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP(KT1002a Reagent C), 37℃湿盒孵育10min;16洗涤:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;17显色:滴加适量DAB显色液(KT1003a)至切片上,室温显色1~5min,自来水冲洗;18复染:苏木素染色5min,蒸馏水冲洗5min;19分化: 0.5%盐酸乙醇混合液中分化,自来水冲洗3-4次, PBS中浸泡10-20秒返蓝,自来水冲洗2次。20脱水:经过70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,无水乙醇浸泡,每次5min;21透明:二甲苯浸泡2次,每次10-15min;22封片:晾干后加中性树胶,盖玻片封片;23结果:显微镜观察,记录结果。
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