13818676837
咨询热线:
专注于精密耗材的研发,生产,销售于一体的高科技企业
热门关键词:
技术文章分类:
全部
  • 10-15
    2015

    合作伙伴

    公司目前代理品牌如下:美国biolegend, 美国peprotech, 美国cst, 美国abcam, 美国santa cruz公司,台湾Abnova,美国Biovision,美国Thermo,美国NEB,美国Abgent,SIGMA Aldrich,美国Hyclone,美国labvision, 美国MRC, 美国Agdia, 美国Jackson, 美国Rd, 美国eBioscience, 美国Axygen, 美国Bio-Rad, 美国Millipore, 美国Qiagen, 美国Novus.
  • 10-15
    2015

    细胞/组织裂解液制备流程

    1.试剂和溶液RIPA buffer:20mM Tris (pH 7.5),150mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,2.5mM sodium pyrophosphate,1mM beta-glycerophosphate disodium salt hydrate,1mM Na3VO4,1µg/ml leupeptin hemisulfate salt,1% sodium deoxycholate,1% Triton X-100,1mM PMSF2.实验步骤--细胞裂解液制备1细胞收集:选择对数生长期的细胞,用预冷的PBS洗涤细胞,3000rpm,离心5min,弃上清;2细胞裂解:将细胞沉淀轻轻弹散,然后加适量预冷的RIPA buffer和PMSF进行裂解(1个100mm直径细胞培养皿加入100-200μl裂解液, 1ml RIPA buffer加10μl PMSF),放置于冰上,轻轻吹散细胞悬液,放置4℃冰箱或冰水混合物中裂解40-60min;3超声处理:首先观察裂解情况,如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理,否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下:设置参数:次数10-30次,每次时间5-10s,取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里(冰上超声),超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清,如果有浑浊,需再次进行超声;4离心测蛋白浓度:13000rpm 4℃,离心8min,取上清。另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度;5细胞裂解液处理:加入适量的5*Loading Buffer,混匀后沸水浴5-10min,取出0.5ml样品进行电泳及WB检测,其它分装置于-20℃保存。3.实验步骤—组织裂解液制备1取组织:新鲜或从-80℃冰箱/液氮中取出需要制备裂解液的组织,待组织解冻后放在盛有PBS液的培养皿中,用镊子夹住组织洗净组织中残留的血,并且尽可能除去脂肪和外膜;2把洗净的组织放入培养皿中,用剪刀将组织剪成小块(尽可能的小);3裂解:将剪碎的组织小块转移至研磨器中,在冰浴中进行研磨一定次数后,加入适量预冷的RIPA buffer和PMSF继续研磨至组织无明显块状即可(一般 1ml RIPA buffer加10μl PMSF);4将研磨好的组织裂解悬液转移至干净的离心管中,再用少量的RIPA buffer和PMSF清洗研磨器并倒入离心管中,冰浴中放置40-60min, 充分裂解,可间隔摇晃离心管或吹打数次;5超声处理:首先观察裂解情况,如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理,否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下:设置参数:次数10-30次,每次时间5-10s,取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里(冰上超声),超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清,如果有浑浊,需再次进行超声;6离心测蛋白浓度:13000rpm 4℃,离心8min,取上清(小心表面的脂肪和管底的组织碎片),另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度;7组织裂解液处理:加入适量的5*Loading Buffer,混匀后沸水浴5-10min,取出0.5ml样品进行电泳及WB检测,其它分装置于-20℃保存。  
  • 10-15
    2015

    免疫荧光显微法(IF)实验操作流程

    1.试剂和溶液10X PBS:80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L纯水,调pH至 7.4洗涤液:1× PBS:纯水稀释10X PBS;1× PBST:含0.05% Tween-20 的1×PBS固定液:4%多聚甲醛:4g多聚甲醛溶于100ml PBS通透液:0.1% triton-100封闭液:PBS配制的3% BSA抗体稀释液:一抗稀释液:3% BSA;二抗及鬼笔环肽稀释液:1X PBS;DAPI: 纯水稀释 2.实验步骤1细胞爬片:将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌,铺在12孔板中,然后接种细胞,置于37℃,5% CO2培养箱过夜,待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态,细胞密度为40%-50%(做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2代后的细胞); 2洗涤:倒掉细胞培养液,1×PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 3固定:4%多聚甲醛固定细胞,室温放置20min,倒掉多聚甲醛,加入适量PBS; 4冻存:-20℃保存(如果直接使用,可跳至7); 5解冻:常温下放置30 min; 6洗涤: PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 7通透:加入适当体积的通透液室温放置10min。(若蛋白为膜表达则无需此步) 8洗涤:PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min; 9封闭:加入适当体积的封闭液,室温放置30 min; 10一抗孵育:倒掉封闭液,加入适当体积及浓度的一抗,37℃孵育60min; 11洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 12二抗孵育:加入适当体积及稀释比的荧光二抗, 37℃避光孵育50 min;(如果一抗是荧光素标记的则无需此步); 13洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 14核染色:加入适当体积及稀释比的核染料DAPI室温反应10min (如果无需加鬼笔环肽,可洗涤后跳至16); 15洗涤:PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min; 16细胞骨架染色:此步骤只针对有细胞核定位的项目;加入反应体积为0.2ml,适当稀释比的鬼笔环肽,避光37℃孵育60 min或4℃孵育过夜; 17洗涤:PBST轻微振荡洗涤2次,每次5min,纯水轻微振荡洗涤5min; 18封片:取干净的载玻片,分别标记和编号,在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂,用镊子取出盖玻片,细胞面朝下,盖在载玻片上; 19荧光显微镜观察,记录结果。 
  • 10-15
    2015

    酶联免疫(ELISA)实验操作流程

    1.溶液和试剂1)10 X PBS: 80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水,调pH至 7.42)包被液:1X PBS 3)洗涤液:含0.05% Tween-20 的1X PBS(1X PBST)或纯水4)封闭液:10 mg/ml BSA(1% BSA,1X PBS配置)5)抗体稀释液:一抗、二抗均用1%BSA-PBS6)2M H2SO4终止显色: 108ml 98%H2SO4,加纯水稀释到1L 2.实验步骤1抗原准备:将抗原按适当浓度溶解于包被液中; 2包被:在对应的孔中加入100μl抗原,37℃孵育2小时或4℃过夜;3洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗5次;  4封闭:每孔加200μl封闭液,37℃孵育1小时;  5洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗3次; 6一抗:每孔加100μl一抗,37℃孵育2小时; 7洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗7次; 8二抗:每孔加100μl二抗,37℃孵育1小时; 9洗涤:倒空液体并拍干残留液体,洗涤液冲洗7次; 10显色:拍干孔中残留液体,每孔加100μl TMB显色液,37℃避光显色10min;11检测:每孔加50μl 2M H2SO4终止显色,并立即读取450nm OD值。 
  • 10-15
    2015

    免疫组织化学(IHC)实验操作流程

    1.试剂和溶液乙醇: 无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇抗原修复液: 0.01M的柠檬酸钠缓冲液:58.82g柠檬酸三钠及7.56g柠檬酸溶于200ml纯水,调pH至 6.0,纯水1:100稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9稀释10X PBS: 80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水,调pH至 7.4洗涤液: 1×PBS:纯水稀释10× PBS;1× PBST:含0.05% Tween-20 的1×PBS(1×PBST)super block,生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent二抗,酶标亲和素UltraTek HRP,DAB显色试剂盒:Cat. KT1002a抗体稀释液:3%BSA-PBS0.5%盐酸-乙醇:0.5~1%盐酸,95.0~95.5%乙醇苏木素:苏木精2g溶于250ml无水乙醇,十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml纯水,以上溶液充分混合,加入碘酸钠 0.2g和冰醋酸20ml 2.实验步骤1组织固定:烘箱温度65-75℃ 30min或者65℃过夜;2脱蜡:二甲苯浸泡三次,每次10分钟;3水化:依次经过无水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇浸泡,每次5min;4洗涤:自来水冲洗1次,PBS浸泡3min;5抗原修复:放入稀释100倍的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0) 中,高压锅煮沸10min,常温冷却30min;6洗涤:纯水浸泡2次,PBS浸泡1次,每次3min;7灭活酶:室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min;8洗涤:纯水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;9封闭:加入适当体积的super block(KT1002a Reagent A),37℃温箱孵育5min;10洗涤:纯水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;11一抗:加入反应体积为0.15ml,适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。12洗涤:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;13加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗(KT1002a Reagent B),37℃湿盒孵育10min;14洗涤:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;15加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP(KT1002a Reagent C), 37℃湿盒孵育10min;16洗涤:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;17显色:滴加适量DAB显色液(KT1003a)至切片上,室温显色1~5min,自来水冲洗;18复染:苏木素染色5min,蒸馏水冲洗5min;19分化: 0.5%盐酸乙醇混合液中分化,自来水冲洗3-4次, PBS中浸泡10-20秒返蓝,自来水冲洗2次。20脱水:经过70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,无水乙醇浸泡,每次5min;21透明:二甲苯浸泡2次,每次10-15min;22封片:晾干后加中性树胶,盖玻片封片;23结果:显微镜观察,记录结果。
  • 10-15
    2015

    免疫印迹(WB)实验操作流程

    1.试剂和溶液1)转印缓冲液:0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇2)氨基黑溶液:0.1% 酸性黑10B3)1×TBST:25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 204)封闭液:TBST配制的5%牛奶5)抗体稀释液:TBST配制的5%牛奶6)显色系统:ECL显色 2.实验步骤1电泳:将裂解液进行SDS-PAGE电泳,80v,30分钟,120v,90分钟;2转膜:PVDF膜在甲醇中浸泡约30秒左右,滤纸浸泡在转印缓冲液预湿,半干法转印到PVDF膜上,10v,150分钟;3染色:氨基黑染色5分钟,甲醇褪去背景色,观察条带;4膜活化:将PVDF膜置于甲醇活化1min,用纯水洗膜2次后再用TBST洗涤3次;5封闭:将膜条置于5%牛奶或2% BSA中,室温混摇2h;6一抗孵育:将待检抗体用3%牛奶或2% BSA稀释到合适浓度(参照抗体说明书,根据客户预实验结果,稀释度上下浮动一个数量级都为正常),将膜放入对应的已稀释待检样品中,置4℃混摇孵育过夜;7洗涤:取出膜放在TBST中洗涤3×5min;8二抗孵育:将膜取出放入稀释好的HRP标记的二抗(参照二抗说明书进行稀释)中,室温混摇2h;9洗涤:取出膜放在TBST中洗涤3×5min;10ECL显色:将膜取出放入混匀的ECL显色液中,孵育3min,将膜取出贴在有荧光角标的胶片上,迅速用保鲜膜包好;11曝光:把底片放在暗盒中,根据荧光强度分别对X光胶片作不同时间段的曝光,曝光结束后,将底片取出,1min显影,30s清洗,1min定影,30s清洗,晾干;12结果分析:用扫描仪将曝光后的X光胶片扫描,做后续结果分析。
请留下您的需求
501816433
13818676837
sh@jzbio.net
上海俊喆生物技术有限公司是一家高新技术企业,成立于2010年,经过多年的不懈努力已经发展成为一家专业从事生物化学,免疫学,细胞生物学及分子生物学试剂的开发、销售、服务的生物技术公司。 公司不但拥有一批掌握现代高科技的市场人员,还有一支训练有素的技术支持队伍; 随时为您提供技术咨询、及售后服务。 公司目前代理品牌如下:美国biolegend, 美国peprotech, 美国cst, 美国abcam, 美国santa cruz公司,台湾Abnova,美国Biovision,美国Thermo,美国NEB,美国Abgent,SIGMA Aldrich,美国Hyclone,美国labvision, 美国MRC, 美国Agdia, 美国Jackson, 美国Rd, 美国eBioscience, 美国Axygen, 美国Bio-Rad, 美国Millipore, 美国Qiagen, 美国Novus. 公司将在未来日趋激烈的市场竞争中争取更大的发展,以先进的经营理念、前瞻的市场洞察力、强大的专业背景和优良的客户服务,在同行业中保持良好的竞争优势,把代理的*新产品和*新的技术带进中国市场,让更多的科研用户享受到*新的国际产品和技术,同时树立、保持在生命科学市场上的前沿地位。
  • 电话咨询
  • 13818676837
None