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三质粒慢病毒包装细胞体系的构建及其感染效率检测
2015-10-15
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目的建立一种基于三质粒的慢病毒包装细胞体系并对其感染效率进行检测.方法利用双酶切方法构建一个pLVTHM重组慢病毒表达载体,然后与pSPAX2,pMD2.G共转染HEK293T获取慢病毒原液,利用高速离心的方法对其进行浓缩纯化.设定不同感染复数(1,5,10,15,20),将上述制备的慢病毒制品感染HEK293T和HepG2肝癌细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达水平以确认制备的病毒是否成功,其感染效率如何.结果利用一段非沉默性基因片段,构建了一个pLVTHM重组慢病毒表达载体,将其与两个包装质粒共转染HEK293T细胞后,荧光显微镜下可见发出明亮绿色荧光,证明上述载体成功转染到包装细胞中.于转染后42h和66h分别收集细胞培养上清,获得含有慢病毒的原液,对病毒进行浓缩后获得浓度为1×108 TU/ml的病毒浓缩液.利用浓缩的病毒感染HEK293T和HepG2细胞,随着感染时间及感染复数值的增加,细胞内绿色荧光表达明显增强,感染后24h 时HEK293T细胞内即可见明亮绿色荧光,其感染效率约为60%;在较难进行基因转染的HepG2细胞中,感染后24h后约40%的细胞可见明亮绿色荧光.结论成功建立了三质粒慢病毒包装细胞体系,该体系可成功表达含有目的基因的慢病毒,为后续系列研究提供了重要的工作平台.

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