产品概述：
Biozellen®3D类器官培养基质胶套装
Biozellen®基质胶 特点：
1、100%植物源材料，无任何动物成分；
2、胺基酸序列100%人源化 ；
3、可调控基质胶硬度进行多种细胞培养；
4、3D细胞/类器官培养种类数量范围更广；
5、无人畜共通病原菌或毒素风险；
6、＊适用于医疗级生物原料；
7、高活性、高纯度、可融化；
8、2年保存时间；
9、3D培养结束后基质胶可以温和融化，并保留3D细胞/类器官结构完整性；
Biozellen®3D类器官培养基质胶套装
Catalog No. B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10
Specification 2ml-kit、4ml-kit 、10ml-kit
Storage Store at-20℃. 1年保存.
一、产品描述
Biozellen®3D类器官培养基质胶套装包含整套基质胶、胶体固定液、胶体溶解液，可应用到3D细胞培养与微环境应用等；本试剂盒操作便利且可调控基质胶硬度进行多种细胞培养测试；植物胶体可快速形成水凝胶， 请操作前详细阅读此使用指南。
（Biozellen®3D类器官培养基质胶材料为植物来源，无动物成分）
二、应用
•3D类器官培养。
•3D细胞球体培养试验
•细胞侵袭
•细胞迁移
•小鼠皮下成瘤
•适合用于3D细胞药物筛检平台
•细胞生长和分化
•代谢/毒理学研究
•体外和体内血管生成分析
三、适用细胞种类
• 原代细胞 • 干细胞
四、试剂盒组分
| B-P-00003-2、B-P-00003-4、B-P-00003-10
（对应数量和内容） |
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货号. | Components | Amount | Content | Storage |
B-P-00003-A | A 基质胶 (2X) | 4、8、20 | 0.5mL / tube | Store at-20℃ |
B-P-00003-C | C 缓冲溶液 (10X) | 1、2、1 | 1*10ml、2*10ml、1*50 mL / BT | Store at 4℃ |
B-P-00003-D | D 缓冲溶液 (10X) | 1、2、1 | 1*10ml、2*10ml、1*50 mL / BT | Store at 4℃ |
五、使用步骤：
A、试剂制备
A基质胶：将A基质胶溶于37℃水浴槽回温10分钟， 确认完全融解.
C缓冲溶液(1X)制备：使用前将10X C缓冲溶液用冰的无细胞培养液(例如： 无血清DMEM、opt-MEM) 制备成 1X C 缓冲溶液。(不要用 PBS 稀释 C 缓冲液) .
D 缓冲溶液(1X)制备: 使用前用冷的 1x PBS 稀释 10X D 缓冲溶液至 1X D 缓冲溶液.
B、Biozellen®3D类器官培养基质胶的制备
全部步骤需要在无菌环境内操作，操作步骤如下：
1. 将24孔培养板放置于冰上预冷。
2. 细胞计数后取 2×105~2×107 细胞与 0.5 毫升 37℃ 培养基均匀混合，并与0.5毫升37℃ A胶按照 1:1 等比例均匀混合，＊终细胞密度1*105~1*107cells/mL。
注：请选择适当的培养溶液与条件进行试验。
3.取 20-40 微升步骤 2 含细胞的混合 A 胶溶液滴于 步骤 1 预冷的培养板上，胶体将于 5 分钟内成胶。 注: 测试胶体是否成胶，可用微量吸管尖温和的触碰胶体表面进行确认。
4.待胶体成胶后，添加1毫升冰的1X C缓冲溶液，并盖过步骤3 的胶溶液，固定 15 分钟。
5.待15分钟固定后，小心的吸取 C 缓冲溶液并置换为适合此细胞生长之培养基溶液。
6将含有细胞的胶于37°C 二氧化碳培养箱内进行7~14天的培养，并观察细胞球体的形成，按正常培养基更换频率进行更换操作。
C、溶胶与收集细胞球体准备程序
小心的将培养基吸取移除，并用1X PBS进行清洗。
小心的将 1X PBS 吸取移除，并添加 1 毫升冰的D缓冲溶液，盖过胶滴于室温反应 5分钟。
温和的用1毫升移液管吸取，直到胶滴完全溶解。
将含有细胞球体的溶液吸入1.5 毫升离心管，用1000 rpm的转速离心10分钟，移除上清液体并收集细胞球体做分析。
D、收集单颗细胞准备程序
在分离单细胞前，先按上述溶胶与收集细胞球体准备程序进行操作
1. 添加trypsin-EDTA并与收集的细胞球体于37°C混合反应。
2. 用1毫升移液管混合，直到细胞体完全分解。
3. 待细胞球体完全分解，加入3倍体积的1X PBS，并用1000转的转速进行离心10分钟，并移除上清液体收集沉淀的单细胞做分析。
E、细胞迁移实验准备程序
1. 准备Transwell装置及无血清DMEM细胞培养液 (用于稀释A胶)。
2. A胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟，确认完全融解。
3. 用无血清DMEM细胞培养液将A胶 (2X)稀释50倍。
4. 根据Transwell上室底部面积加入100-120 ul/cm2稀释后的A 胶稀释液到Transwell上室中。
5. 将步骤4在4 ℃冰箱孵育30分钟。
6. 将多余的稀释液吸出，并在Transwell上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约7.5 x 104 cells/well.。
7. 在Transwell下室中加入含10 %血清的细胞培养液做为chemoattractant，吸引癌细胞系进行迁移。
F、细胞侵袭实验准备程序
1. 准备Transwell装置及无血清DMEM细胞培养液 (用于稀释A胶)。
2. A胶 (2X) (货号: B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟，确认完全融解。
3. 用无血清DMEM细胞培养液将A胶 (2X)稀释1-2倍。
4. 根据Transwell上室底部面积加入70-80 ul/cm2稀释后的A 胶稀释液到Transwell上室中。
5. 将步骤4在4 ℃冰箱或者冰上孵育10分钟（＊好用冰包埋起来）。
6. 用冰的无血清细胞培养液 稀释C缓冲溶液(10X) (货号: B-P-00003-C ) 至1X C 缓冲溶液。(不可用PBS稀释).
7. 步骤5孵育时间结束后再加入70-80 ul/cm2预冷稀释后的1X C 缓冲溶液。 (C缓冲溶液用于A胶成胶反应)
8. 将步骤7在4 ℃冰箱或者冰上孵育15分钟（＊好用冰包埋起来）。
6. 形成胶体后，将多余的稀释液吸出。
7. 在成胶完成的Transwell上室中加入无血清的癌细胞系细胞悬浮液使细胞浓度约7.5 x 104 cells/well.。
7. 在Transwell下室中加入含10 %血清的细胞培养液做为chemoattractant，吸引癌细胞系进行迁移及分泌基质蛋白酶 (MMP) 侵袭。
G、小鼠皮下成瘤实验准备程序
1. 将 A胶 (2X) (货号:B-P-00003-A) 置于37 ℃水浴槽回温10分钟，确认完全融解。
2. 将C缓冲溶液(10X) 货号:B-P-00003-C)与冰的无血清细胞培养液 (例如: 无血清DMEM或内含VEGF、heparin的无血清DMEM) 按1:4比例均勻混合配置。(例如:1 ml C缓冲溶液(10X) 與 4 ml 无血清DMEM混合，不可用PBS稀释)
3. 将 A胶 (2X) 与约2*106 cells/ml的癌细胞系悬浮液按1:1等比例均匀混合配置，癌细胞系悬浮液＊终浓度约为106 cells/ml。
4. 选用21-25 G的针头 (避免破坏细胞)，抽取0.2-0.3 ml 预冷稀释后的C缓冲溶液。(C缓冲溶液用于A胶成胶反应)
5. 使用步骤4的同一支针管，再抽取0.1-0.7 ml含细胞的A胶混合液，在冰上孵育五分钟。
6. 以皮下注射方式注射0.3-1.0 ml至小鼠。(需一次注射完含C缓冲溶液的A膠混合液)
注1: 注射体积可依不同实验目的做调整，若为血管生成研究注射体积需至少0.5 ml。
注2: 此步骤依实验需求可执行或不执行，若需呈现明显的皮下注射隆起效果，可于注射完毕后，在小鼠注射部位冰敷5-10分钟。
7. 培养一至三周后可摘取接种的肿瘤组织。
注3: 若为血管生成研究，应注射含VEGF及heparin的A胶，以促进血管生成。约三天后，可摘取含有新血管生成的肿瘤组织。
六、案例分享
A.形成3D肿瘤球体成功案例分享
B.Biozellen基质胶被溶解后分离的完整3D细胞结构照片
培养后的3D细胞球体， 在Biozellen基质胶被试剂盒里面的
D Buffer溶解分离后仍然可以得到完整的3D细胞结构
说明书：
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引用及参考文献：
