1.试剂和溶液
RIPA buffer：20mM Tris (pH 7.5)，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1mM EGTA，2.5mM sodium pyrophosphate，1mM beta-glycerophosphate disodium salt hydrate，1mM Na3VO4，1µg/ml leupeptin hemisulfate salt，1% sodium deoxycholate，1% Triton X-100，1mM PMSF
2.实验步骤--细胞裂解液制备
1 | 细胞收集：选择对数生长期的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞，3000rpm，离心5min，弃上清； |
2 | 细胞裂解：将细胞沉淀轻轻弹散，然后加适量预冷的RIPA buffer和PMSF进行裂解（1个100mm直径细胞培养皿加入100-200μl裂解液， 1ml RIPA buffer加10μl PMSF），放置于冰上，轻轻吹散细胞悬液，放置4℃冰箱或冰水混合物中裂解40-60min； |
3 | 超声处理：首先观察裂解情况，如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理，否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下：
设置参数：次数10-30次，每次时间5-10s，取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里（冰上超声），超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清，如果有浑浊，需再次进行超声； |
4 | 离心测蛋白浓度：13000rpm 4℃，离心8min，取上清。另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度； |
5 | 细胞裂解液处理：加入适量的5*Loading Buffer，混匀后沸水浴5-10min，取出0.5ml样品进行电泳及WB检测，其它分装置于-20℃保存。 |
3.实验步骤—组织裂解液制备
1 | 取组织：新鲜或从-80℃冰箱/液氮中取出需要制备裂解液的组织，待组织解冻后放在盛有PBS液的培养皿中，用镊子夹住组织洗净组织中残留的血，并且尽可能除去脂肪和外膜； |
2 | 把洗净的组织放入培养皿中，用剪刀将组织剪成小块（尽可能的小）； |
3 | 裂解：将剪碎的组织小块转移至研磨器中，在冰浴中进行研磨一定次数后，加入适量预冷的RIPA buffer和PMSF继续研磨至组织无明显块状即可（一般 1ml RIPA buffer加10μl PMSF）； |
4 | 将研磨好的组织裂解悬液转移至干净的离心管中，再用少量的RIPA buffer和PMSF清洗研磨器并倒入离心管中，冰浴中放置40-60min, 充分裂解，可间隔摇晃离心管或吹打数次； |
5 | 超声处理：首先观察裂解情况，如液体澄清说明裂解充分无需进行超声处理，否则裂解液不充分需要进行超声处理。方法如下：
设置参数：次数10-30次，每次时间5-10s，取出4℃冰箱或冰浴的细胞裂解悬液置于超声仪里（冰上超声），超声完毕后需观察细胞裂解液是不是澄清，如果有浑浊，需再次进行超声； |
6 | 离心测蛋白浓度：13000rpm 4℃，离心8min，取上清（小心表面的脂肪和管底的组织碎片），另取10μl样品用Coomassie Brilliant Blue法测定蛋白浓度； |
7 | 组织裂解液处理：加入适量的5*Loading Buffer，混匀后沸水浴5-10min，取出0.5ml样品进行电泳及WB检测，其它分装置于-20℃保存。 |
