1.试剂和溶液
10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L纯水，调pH至 7.4
洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS
固定液：4%多聚甲醛：4g多聚甲醛溶于100ml PBS
通透液：0.1% triton-100
封闭液：PBS配制的3% BSA
抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释
2.实验步骤
1 | 细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12孔板中，然后接种细胞，置于37℃，5% CO2培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2代后的细胞）； |
2 | 洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min； |
3 | 固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适量PBS； |
4 | 冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）； |
5 | 解冻：常温下放置30 min； |
6 | 洗涤： PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min； |
7 | 通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。（若蛋白为膜表达则无需此步） |
8 | 洗涤：PBS轻微振荡洗涤2次,每次5min； |
9 | 封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min； |
10 | 一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min； |
11 | 洗涤：PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min； |
12 | 二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗， 37℃避光孵育50 min；（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）； |
13 | 洗涤：PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min； |
14 | 核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI室温反应10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）； |
15 | 洗涤：PBST轻微振荡洗涤3次,每次5min； |
16 | 细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min或4℃孵育过夜； |
17 | 洗涤：PBST轻微振荡洗涤2次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min； |
18 | 封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上； |
19 | 荧光显微镜观察，记录结果。
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